27 بهمن ماه 1358 حضرت آیت‌الله خامنه‌ای در انتخابات نخستین دوره‌ی مجلس شورای اسلامی اعلام نامزدی کردند. ایشان در این انتخابات از سوی چندین سازمان و گروه اسلامی مورد حمایت قرار گرفته و با کسب بیش از یک میلیون و چهارصد هزار رأی، از حوزه‌ی انتخابیه‌ی تهران وارد مجلس شدند. ایشان به عضویت کمیسیون امور دفاعی درآمده و به ریاست آن انتخاب شدند. در مدت ریاست ایشان، طرح‌ها، لوایح و موضوعات متعددی در کمیسیون امور دفاعی بررسی شد که از مهم‌ترین آنها می‌توان ادغام سازمان بسیج مستضعفین در سپاه پاسداران، مسئله‌ی کردستان، مسائل مرزی، مسئله‌ی بلوچستان و سازماندهی نوین ارتش را نام برد. از مواضع مهم حضرت آیت‌الله خامنه‌ای در دوره‌ی نمایندگی نیز می‌توان به صحبت‌های مهم و مستند ایشان در موافقت با طرح عدم کفایت سیاسی بنی‌صدر برای ریاست‌جمهوری اشاره کرد. آیت‌الله خامنه‌ای در جلسه‌ی بررسی کفایت سیاسی بنی‌صدر در مجلس، چهارده دلیل برای عدم کفایت سیاسی او برشمردند از جمله: عدم احترام به نهادهای قانونی، استفاده از هر ابزاری در مقابله با مخالفان، راستگو نبودن، رعایت نکردن حیثیت جمهوری اسلامی در خارج از کشور، به‌کارگیری مشاوران بدنام و مشکوک، افشای اسرار اقتصادی کشور، ایجاد تشنج در کشور پیش از جنگ و حرکت به سمت قدرت مطلقه و استبداد. با انتخاب آیت‌الله خامنه‌ای به مقام ریاست جمهوری در مهر ۱۳۶۰ ایشان قوه‌ی مقنّنه را ترک گفتند.